安琪30年
食用酒精及燃料乙醇

食用酒精及燃料乙醇

安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生

发布人:酿造及生物能源事业部    发表时间:2014-02-26

  郑州1,田辉1,程金花1,赵儒铭1,李志军2,姚娟2,龚大春1

  (1.三峡大学艾伦窑麦克德尔米德再生能源研究所,湖北宜昌443002曰2.安琪酵母股份有限公司,湖北宜昌443002)

  摘要: 通过紫外诱变筛选得到呼吸缺陷型酿酒酵母R40,再以R40和管囊酵母P01为亲本,进行原生质体制备与再生的研究,考察了酶浓度、酶解温度和酶解时间对两亲本原生质体制备和再生的影响。结果表明,当酶解时间为1 h,酶浓度为2 %时,35 ℃下酶解酿酒酵母R40 所得原生质体的形成率和再生率分别达到96.1 %和12.5 %;30 ℃下酶解管囊酵母P01所得原生质体的形成率和再生率为97.2 %和10.1 %。

  关键词: 微生物; 安琪酿酒酵母; 呼吸缺陷型; 管囊酵母; 原生质体; 再生

  中图分类号院TS261.1曰Q813曰Q93-3 文献标识码院A 文章编号院1001原9286(2011)08原0017原04

  随着石油资源日益减少,研究与开发可再生、可持续发展的资源与能源越来越重要。木质纤维素作为地球上最大的再生碳水化合物资源,正成为各国重点开发的对象[1]。在木质纤维素结构中既含有30 %左右的六碳糖葡萄糖聚合物纤维素,又含有30 %左右的五碳糖聚合物半纤维素。一般酿酒酵母只能利用六碳糖,因此为了提高木质纤维素的生物加工经济性,必须寻找和开发既可发酵六碳糖的,也可发酵五碳糖的酵母。

  自今人们研究最多且最有工业应用前景的戊糖发酵微生物是3 种酵母菌种[2],即休哈塔假丝酵母(Candi-da shebatae)、树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus),其戊糖发酵酒精得率在0.28~0.48 g/g(产生的酒精/ 消耗的戊糖)。人们主要利用基因重组方法中的原生质体融合技术进行菌株改造,获得己糖或戊糖的发酵优良菌株[3],但利用此方法开发全糖发酵菌株尚不多见。高艳[4]等人利用河南南阳天冠集团酵母开展了原生质体制备和再生条件的研究,为选育浓醪发酵酵母提供菌种。涂振东[5]等人利用原生质融合和各种诱变技术对季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii Candida shehatea)进行育种,但未能得到高产乙醇的诱变菌株。河南农业大学的陈红歌课题组[6]利用原生质体融合技术构建纤维素燃料乙醇全糖发酵高产菌株,利用得到的融合子进行全糖发酵,得到的酒精度仅为1.3 mL/100 mL(v/v)。白罚利等[7]人利用模式菌株酿酒酵母与嗜鞣管囊酵母进行了原生质体的制备和再生,但没有遗传标记,后期融合难以判断。

  本文用从安琪股份有限公司的优质酿酒酵母筛选得到的单倍体菌株和实验室嗜鞣管囊酵母为亲本,通过选育呼吸缺陷型酿酒酵母作标记,探讨和优化两个亲本原生质体的制备和再生条件,为进一步的原生质体融合提供必要的技术准备。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 菌种

  单倍体酿酒酵母H06,由安琪公司提供的耐高温酿酒高活性干酵母活化、筛选得到曰管囊酵母P01,本实验室保藏。

  1.1.2 培养基

  YEPD 培养基院葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,酵母膏1 g,蒸馏水100 mL。

  YEPDS培养基院葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,酵母膏1 g,琼脂粉2 g,蒸馏水100 mL。

  甘油固体培养基院甘油2 g,蛋白胨2 g,酵母膏1 g,琼脂粉2 g,蒸馏水100 mL。

  再生培养基院在YEPDS 培养基中加入1.2 mol/L 山梨醇。

  TTC 下层培养基院葡萄糖1 g,蛋白胨0.2 g,酵母膏0.15 g,KH2PO4 0.15 g,Mg2SO4 0.04 g,琼脂粉2 g,蒸馏水100 mL,pH5.5。

  TTC 上层培养基院葡萄糖0.5 g,TTC 0.05 g,琼脂粉1.5 g,蒸馏水100 mL(灭菌以后加入经过膜过滤的TTC溶液。

  酿酒酵母发酵培养基院葡萄糖6 g,MgSO4 0.2 g,NH4NO3 0.5 g,KH2PO4 0.5 g, CaCl2 0.2 g,NaCl 0.1 g,酵母抽提物0.3 g,蛋白胨0.3 g,吐温80 6滴,蒸馏水100 mL。

  管囊酵母发酵培养基[6]院总糖6 g,MgSO4 0.1 g,KH2PO4 0.2 g,(NH4)2SO4 0.3 g,蛋白胨0.36 g,酵母膏0.4 g,肌醇0.015 g,蒸馏水100 mL初始pH为5.0。

  除特殊说明,以上培养基均在121℃下灭菌30 min。

  1.1.3 试剂

  缓冲液0.1 mol/L pH5.0的磷酸缓冲液。

  高渗缓冲液院1.2 mol/L山梨醇,用缓冲液配制(购于上海源聚生物科技有限公司)。

  预处理剂院0.1 % 茁-巯基乙醇(购于上海源聚生物科技有限公司,分析纯);0.07 mol/LEDTA-Na2曰用高渗缓冲液配制。

  稳渗液院1.2 mol/L山梨醇,用蒸馏水配制。

  1.1.4 酶制剂

  蜗牛酶(购于上海源聚生物科技有限公司),用高渗缓冲液溶解,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。

  1.2 方法

  1.2.1 亲本菌株生长曲线的测定

  用20 mL 无菌生理盐水将酵母从斜面培养基上冲洗下来,倒入无菌三角瓶中,混匀后分别接1 mL于25个装有50 mL YEPD培养基的250 mL 三角瓶中,置于摇床中培养,培养条件院28 ℃,200 r/min。

  以未接入酵母的YEPD 培养基为空白,每隔2 h取出1瓶测定600 nm下酵母菌的吸光度,绘制时间OD 600nm曲线。

  1.2.2 呼吸缺陷型菌株的筛选[8]

  选取对数生长中后期的单倍体菌株种子发酵液,用生理盐水适当稀释,使菌体个数在107个/mL左右,再用生理盐水稀释到10-5,取10-3、10-4、10-5的菌液于30 cm、15 W 紫外灯下分别照射0 s、10 s、20 s、30 s、40 s,取0.1 mL 涂布于YEPD 培养基上,28 ℃培养48 h,然后根据培养基上生长的菌落数计算存活率,绘制时间-存活率曲线。并用无菌牙签挑取存活率在20 %左右时的照射时间下得到的较小菌落于TTC下层平板培养2 d,之后倒入TTC上层培养基培养2 h,找出TTC 上层平板上的白色菌落转接入甘油固体培养基上进一步鉴定。

  1.2.3 呼吸缺陷型菌株发酵产乙醇的测定

  用1.2.1 的方法测定呼吸缺陷型酵母菌株的生长曲线,将呼吸缺陷型菌株于YEPD培养基中培养过夜,接入发酵培养基中培养120 h,取样测定残糖、乙醇含量。

  1.2.3.1 残糖测定

  采用3、5-二硝基水杨酸法(DNS法)[9]。

  1.2.3.2 乙醇测定

  选择正丙醇为内标物,色谱条件院柱温为85 ℃,检测器温度为155 ℃。进样器温度为160 ℃。载气为高纯氮气,流速28.1 mL/min。氢气流速为21.73 mL/min曰空气流速125.55 mL/min。尾吹院22.73 mL/min。进样量2 μL。

  样品测定院以1.0 %的乙醇标样(含1.0 %的正丙醇)测校正因子。根据测得的残糖量计算出转化得到的理论乙醇含量,将发酵液离心得到的上清液适当稀释,加入内标物正丙醇,使其含量为1 %,再用0.22 滋m 的微孔滤膜过滤即得样品。在上述色谱条件下进样,得峰面积,根据校正因子得出乙醇浓度。

  1.2.4 原生质体制备与再生

  酵母原生质体的制备,主要采用的是蜗牛酶,蜗牛酶的最适酶解温度在30~40℃之间,以筛选得到的呼吸缺陷型菌株和实验室保藏的管囊酵母为出发菌株,根据文献[10]的方法,按1.1.3 的试剂和1.1.4 的酶制剂,制备原生质体,选用L9(3)4正交表考察酶浓度、酶解温度和酶解时间对酵母原生质体形成和再生的影响,测定形成率和再生率。

  2 结果与分析

  2.1 生长曲线

  对亲本和呼吸缺陷型酿酒酵母的生长曲线进行考察,酿酒酵母单倍体H06的生长曲线见图1,管囊酵母P01 生长曲线见图2,酿酒酵母呼吸缺陷型R40生长曲线见图3。

  由图1~图3 可知,酿酒酵母单倍体菌株H06 对数生长中后期在12~14 h,管囊酵母P 和酿酒酵母R40的对数生长前期分别为14~16 h和8~10 h。

  2.2 安琪酿酒酵母呼吸缺陷型菌株

  对呼吸缺陷型酵母采用紫外诱变筛选,结果见图4~图6。

  由图4~图6可知,紫外照射20 s时,酿酒酵母存活率为18.6 %,选取此照射时间下培养得到的较小菌落于TTC培养基上培养得到7 株显白色的菌落,且这7株候选菌株在甘油培养基上不能生长。

  2.3 呼吸缺陷型菌株发酵葡萄糖产乙醇

  对7 株候选菌株发酵产乙醇能力进行检测,结果见表1。

  由表1 可知,R40 菌株发酵产乙醇能力明显强于其他6 株,因此将R40 菌株转接于新鲜斜面上于28 ℃培养备用。

  2.4 酶反应条件对酵母原生质体形成和再生的影响

  酶反应条件分别确定为酶浓度、酶解温度和酶解时间(见表2),考察酶反应条件对酵母原生质体形成和再生的影响,结果见表3。

  通过对表3 正交试验结果的直观分析和极差分析得出,影响R40 菌株原生质体形成的因素排序为,酶解温度B>酶解时间C>酶浓度A,且最佳组合为A2B3C2曰而影响R40 菌株原生质体再生的因素排序为,酶解温度B>酶浓度A>酶解时间C,最佳组合为A3B2C1。综合平衡,选取A3B3C2和A3B2C2水平进行试验,A3B3C2得到原生质体的形成率和再生率分别为80.4 %和4.9 %曰A3B2C2得到的原生质体的形成率和再生率分别为96.1 %和12.5 %,相对A3B2C1形成率提高了29.4 %,且再生率也满足实验要求,因此,取A3B2C2为R40 原生质体形成和再生的最优组合,即添加酶浓度20 g/L,酶解温度35 ℃,酶解时间1.0 h。

  通过对表4正交试验结果的直观分析和极差分析得出,影响P01 菌株原生质体形成最重要的因素排序为,酶解温度B>酶解时间C>酶浓度A,且最佳组合为A3B1C3曰而影响P01 菌株原生质体再生的因素排序为酶解温度B>酶解时间C>酶浓度A,最佳组合为A3B3C2。综合考虑,分别选取A3B3C3和A3B1C2水平进行试验,A3B3C3组合得到的原生质体形成率很高,达到了99.1 %,但再生率几乎为0曰A3B1C2组合得到的原生质体形成率和再生率分别为97.2 %和10.1 %,虽然其再生率略低于A3B3C2组合,但其形成率提高了11.6 %,因此,综合考虑,A3B1C2组合是P01 菌株原生质体制备和再生的最优组合,即添加酶浓度20 g/L,酶解温度30 ℃,酶解时间1.0 h。

  3 结论

  通过紫外诱变筛选得到1 株发酵葡萄糖性能优于亲本且带有稳定标记的呼吸缺陷型酿酒酵母,再以此酵母和管囊酵母为亲本,进行原生质体制备与再生的研究,考察了酶浓度、酶解温度和酶解时间对两亲本原生质体制备和再生的影响,R40菌株选取酶解条件为院添加酶浓度20 g/L,酶解温度35 ℃,酶解时间1.0 h曰P01 菌株选取酶解条件为院添加酶浓度20 g/L,酶解温度30 ℃,酶解时间1.0 h。实验得到了较理想的原生质体形成率和再生率,为后期原生质体融合提供了良好的技术基础。

  参考文献

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  [4] 高艳,谭兴和,周红丽,等.南阳酵母2.577 原生质体制备和再生条件的研究[J].食品科技,2008(8):5-9.

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