雷锦成1，常煦1，宋焕禄2，许倩倩2
（1. 安琪酵母股份有限公司酿造与生物能源事业部，酿造与生物能源研究所， 宜昌，443003；2. 北京工商大学化学与环境工程学院,北京,100037）
摘要：应用顶空-固相微萃取（HS-SPME）结合气质色谱连用（GS-MS）的方法研究酱油酵母在酱油生产中的应用效果，主要从香气角度阐述了酱油酵母在酱油生产中的贡献，分别从对香气主体影响、乙醇浓度、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚等香型物质的含量变化来体现人工添加（补充）酵母在酱油生产中的优越性。
关键词：酱油生产、酱油酵母、HS-SPME、GS-MS、增香
酱油是中国最传统的调味品之一，随着酱油产业不断发展和进步，酱油越来越多的走入世界各地的普通百姓家庭，如今酱油已经成为包括欧美国家在内的重要的调味品之一[1]。
日式酱油是现在世界酱油市场的一个典型代表，人工添加酵母菌、乳酸菌是日式酱油生产不同于中式酱油生产的一个明显区别[2]。许多学者和工厂都致力于通过改变酱油发酵工艺和条件，从而酿制出品质更佳的酱油[3-4]。酱油酵母是酱油香气的重要来源之一[5-6]。关于酱油酵母对酱油香气的影响，包括日本学者在内的众多学者对酱油的香气成分做了相当多的研究[7-8]。酱油的香气是一个复合作用的结果，其中，酱油酵母在酱油香气形成上起了非常重要的作用[9]。以鲁氏酵母为主发酵酵母产生的乙醇是很多酯类物质的前体，以球拟酵母为主发酵酵母产生的4-甲基愈创木酚和4-甲基苯酚物质是酱香味的重要来源。此外，酱油酵母还涉及到了诸如糠醇、苯乙醇、丙三醇等多种物质的合成，对于最终酱油酿制产品的风味有至关重要的作用。
材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 酱油样品
本次的酱油样品分别取自A、B、C、D、E、F六个酱油工厂，每个工厂依照自己的实际生产情况，进行酵母添加，所检测样品皆有对照样。
主要试剂
3-甲基-2-庚酮、正己烷均为色谱级，购于美国Sigma公司。
主要仪器
固相微萃取头：加拿大Supelco公司；气象色谱质谱连用仪（GC6890-MS5975）：美国Agilent公司。
实验方法
1.2.1 样品萃取
制样前首先将SPME萃取纤维头(CAR/PDMS,75μm)在GC进样口进行老化，老化温度为250℃，时间30min。
取5g样品放入15ml SPME萃取小瓶中，在50℃下平衡30min。然后将SPME萃取针插入萃取小瓶顶空吸附40min。
样品检测
吸附完成后，迅速将萃取头取出，插入GC进样口进样，萃取头在进样口需热解析10min。
气相色谱的程序升温、质谱条件及GC-O的条件如下：
样品进样后，通过气象色谱毛细管柱进行分离，然后按照1:1:1的比例分流，分流后的样品分别进入气相色谱FID检测器、质谱检测器(MSD)及嗅闻口(ODP),样品同时进入3个检测器，减小了实验分析误差。
气相色谱程序升温为：起始温度为40℃，保持3min，以5℃/min升到200℃，保持0min,再以15℃/min升到260℃，保持3min。
质谱电子方式为EI，电子能量为70eV,离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃。溶剂延迟为3min。质谱质量扫描范围35～650amu。化合物的质谱鉴定在谱库NIST 05a中进行。气相色谱和质谱接口处的温度为240℃和280℃。
样品测定
本次实验全部采用半定量测定方法，以2-甲基-3-庚酮为内标物，对所检测的物质进行办定量测定，半定量测定方法并不能完全显示酱油中的准确含量，但是可以显示在同等条件下，样品与对照样品之间某成分的含量变化。
结果与讨论
酱油酵母对各厂酱油整体香味影响
各厂的酱油香味由于其原料配比、发酵工艺以及地方菌群的不同，或多或少有一定的差异，就以香味组成来说，不同原料配比、发酵工艺、地方气候都会给各自酱油产品的香味组成有一定的影响[10]，表1表示的是各个酱油厂样品在添加酱油酵母（鲁氏酵母&球拟酵母）所检测到的主要香味型物质个数。
表1. 添加酱油酵母前后香气个数比较
| A | B | C | D | E | F |
香味个数OFF | 39 | 48 | 54 | 40 | 35 | 35 |
香味个数ON | 40 | 48 | 52 | 40 | 36 | 36 |
相差个数OFF-ON | +1 | 0 | -2 | +2 | +1 | +1 |
OFF：不加安琪酱油酵母酿制酱油；ON：加安琪酱油酵母酿制酱油
个别物质分别在OFF与ON中独立检出，所以香味个数相同，但是同样会有差别，例如D厂
表1显示，在加入酱油酵母前后，酱油中的香味成分组成并没有很大变化，也就是说，在加入酱油酵母以后，对酱油香气的整体构成结构并没有带来大的变化，其独特香味成分大都可以得到保留，酱油在添加酱油酵母前后都可以保持其自有的香味构成。从六个工厂所反馈的信息情况看，绝大多数工厂都认为自己的酱油香气有一定程度的改观，趋势向好。
酱油酵母对各厂酱油乙醇含量的影响
表2显示的是在添加酵母（鲁氏酵母）后，各厂酱油样品和对照样品的一个乙醇含量变化。
表2. 添加安琪酱油酵母对酱油乙醇含量的影响
| A（μg/μL） | B（μg/μL） | C（μg/μL） | D（μg/μL） | E（μg/μL） | F（μg/μL） |
OFF | 6.7134 | 24.0412 | 21.4599 | 59.8793 | 45.9811 | 75.9524 |
ON | 7.4741 | 45.9508 | 42.2670 | 90.3839 | 240.3393 | 114.9789 |
含量提高比 | 11.3311% | 91.1334% | 96.9680% | 50.9435% | 422.6915% | 51.3828% |
OFF：不加安琪酱油酵母酿制酱油；ON：加安琪酱油酵母酿制酱油
表中数据单指样品相对值，最终结果显示酱油产品中乙醇的增加量
乙醇本身具有芳香、刺激性（宜人）的气味。酱油中的乙醇不但可以丰富酱油的香气，而且使口感更加醇厚。检测结果显示，在加入酱油酵母酿造的酱油中，乙醇含量都有了不同程度的提升，由于生产工艺、生产条件、生产原料等原因，其增加量有明显的差别，但是可以肯定的是，酱油酵母在酱油酿造过程中，拥有较好的乙醇生产能力，在酱油酿制过程中人工添加（补充）酱油酵母可以提高酱油中的乙醇含量，从部分酱油工厂得之，添加酱油酵母后，酱油香气的形成速度要显著提高，对于发酵90天的高盐稀态工艺来说，部分厂家反馈，加入酱油酵母以后，可以将酱油酿制时间缩短10天左右，而不降低（略微提高）酱油品质。
酱油酵母对各厂酱油4-EP和4-EG含量的影响
4-乙基愈创木酚（4-EG）和4-乙基苯酚（4-EP）是酱油中非常重要也是代表性的芳香族化合物，尤其对酱油的酱香产生非常重要的影响。表3和表4显示的是加入酱油酵母（球拟酵母）后对这两种物质的影响。
表3. 添加安琪酱油酵母对酱油4-EG含量的影响
| A（μg/μL） | B（μg/μL） | C（μg/μL） | D（μg/μL） | E（μg/μL） | F（μg/μL） |
OFF | * | 1.8656 | 0.1680 | 0.3921 | 1.3686 | 31.5350 |
ON | * | 18.1489 | 0.4156 | 0.5156 | 15.6820 | 47.7454 |
含量提高比 | - | 872.8184% | 147.3810% | 31.4971% | 1045.842% | 51.4045% |
OFF：不加安琪酱油酵母酿制酱油；ON：加安琪酱油酵母酿制酱油
表中数据单指样品相对值，最终结果显示酱油产品中4-EG的增加量
“*”表示物质微量
表4. 添加安琪酱油酵母对酱油4-EP含量的影响
| A（μg/μL） | B（μg/μL） | C（μg/μL） | D（μg/μL） | E（μg/μL） | F（μg/μL） |
OFF | * | 1.5228 | 0.0422 | 0.1413 | 0.4947 | 0.8399 |
ON | * | 3.2428 | 0.0461 | 0.2068 | 3.7243 | 1.1370 |
含量提高比 | - | 112.9498% | 9.2417% | 46.3553% | 652.8401% | 35.3733% |
OFF：不加安琪酱油酵母酿制酱油；ON：加安琪酱油酵母酿制酱油
表中数据单指样品相对值，最终结果显示酱油产品中4-EP的增加量
“*”表示物质微量，可能未添加球拟酵母
中国的酱油市场有非常明显的中国特色，最直观的是，日式酱油的单批次生产周期都在6个月左右，甚至更长时间，而中国酱油的生产周期绝大多数都不会超过4个月。4-EG、4-EP这两种物质主要是经过球拟酵母发酵而来的，球拟酵母在酱油生产中属于后发酵酵母。由于中国生产厂家大多数后酵时间短，野生球拟酵母无法在自然状态下快速进行4-EG与4-EP的合成，所以中国酱油中的4-EG和4-EP普遍偏低，而在酱油酿造中直接加入球拟酵母可以非常好的解决这个问题。即可以缩短发酵时间，相对提高4-EG与4-EP的含量，最终提高酱油品质。
酱油酵母对各厂酱油4-EP和4-EG含量的影响
在本次检测中，客观的讲，并不是所有的生产厂家在使用酱油酵母以后，上述所提到的物质都有显著的提高。表5是关于这些物质各厂样品检测的情况。
表5. 添加安琪酱油酵母后相关物质变化情况
| 2,3-二丁醇（家） | β-苯乙醇（家） | 糠醇（家） |
含量有显著提高数 | 5 | 3 | 4 |
含量基本持平 | 0 | 2 | 1 |
略有下降 | 1 | 1 | 1 |
数据比较均是各厂添加酱油酵母与未添加酱油酵母所酿酱油进行比较
数据结果显示，在添加了酱油酵母以后，对于大多数与酵母相关重要物质含量都得到了提升。说明在大多数厂家安琪酱油酵母都正确的发挥了自己的生物活性，对于个别厂家相关物质并没有很大变化，甚至略微有点下降，可能原因主要还是原料、生产工艺以及酵母是否正确使用等导致。
结论
从本次检测结果可以看到，在酱油酿制过程中加入酱油酵母，不会对各酱油产地所产酱油的主体香味产生负面影响，基本可以保持其酱油的独特香味成分。其次，加入酱油酵母以后，所酿制酱油中的乙醇、4-EG、4-EP、2,3-二丁醇等多种物质的含量都有一定量的提升，这些物质对改善酱油香气起到积极的作用，此外，例如糠醇等物质的增加在一定程度上还可以增加酱油的防霉性。由此来看，在酱油酿制过程中添加酱油酵母是很好的改善酱油品质的手段。
在酱油酿制过程中添加酱油酵母可以有效改善酱油风味，提高酱油品质，已经得到了酱油企业的公认。目前，已有不少酱油工厂自己建立起了扩配酵母生产工艺，在自身酱油生产过程中添加酵母，以此达到酱油快速增香的目的。另外，现在为了适应新形势下的酱油生产，已经有商品化的酱油干酵母问世，不仅方便酱油工厂的使用，同时还可以保证酱油酵母的品质。
参考文献
[1] 徐清萍. 酱油生产技术问答[M]. 北京：中国纺织出版社, 2011, 1-26.
[2] 包启安. 酱油科学与酿造技术[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2011, 128-153.
[3] 林祖申. 从生产工艺入手如何提高酱油的质量风味[J]. 中国酿造, 2010, (9): 13-15.
[4] Catrinus van der Sluis, Johannes Tramper, Rene H. Wijffels. Enhancing and accelerating flavour formation by salt-tolerant yeasts in Japanese soy-sauce processes[J]. Trends in Food Science & Technology, 2001, 12(9): 322-327.
[5] 卢美欢, 李利军, 贺建超. 耐盐产酯酵母在酱油生产中的应用研究进展[J]. 中国调味品, 2010, 35(10), 48-51.
[6] 陈彬, 鲁绯, 王夫杰. 酱油增香发酵用耐盐酵母菌的生理生化特性分析及菌种鉴定[J]. 中国酿造, 2010, (11), 42-45.
[7] Shigehiro Kataoka. Functional effects of Japanese style fermented soy sauce(Shoyu) and its components[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100(3): 227-234.
[8] 阎玉林. 酱油和香醋成分的测定及生产工艺鉴定研究[D]. 华中农业大学硕士学位论文. 2008, 13-16.
[9] Makio Kobayashi, Satomi Hayashi. Supplementation of NaCl to starter culture of the soy yeast Zygosaccharomyces rouxii[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998, 86(6): 642-644.
[10] Michael Jansen, Janine H. Veurink, Gert-Jan W. Euverink. Growth of the salt –tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii in microtiter plates: effects of NaCl, PH and temperature on growth and fusel alcohol production from branched-chain amino acids[J]. FEMS Yeast Research, 2003, 3(3): 313-318.
The application effect of active dry soy sauce yeast in soy sauce production
LEI Jin-cheng1, CHANG Xu1, SONG Huan-lu2, XU Qian-qian2
Brewing & Bioenergy Research Institution, Brewing & Bioenergy Business Unit, Angel Yeast Co., Ltd, Yichang 443003, China
College of Chemical & Environmental Engineering, Beijing Technology & Business University, Beijing 100048, China）
Abstract: Head-Space Solid-phase micro-extraction (HS-SPME) and capillary gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to determinate aroma components in soy sauce. The application effect of soy sauce yeast in soy sauce production was discussed, especially in main effect of alcohol, Phenol, 4-ethyl-2-methoxy-(4-EG), Phenol, 4-ethyl-(4-EP), etc. The test result shows adding active dry soy sauce yeast can improve the quality of soy sauce.
Keywords：soy sauce production, soy sauce yeast, HS-SPME, GS-MS, aroma improvement