酵母添加在酱油浇淋工艺中的应用

酵母添加在酱油浇淋工艺中的应用

　　权武1，何广会1，常煦2，雷锦成2

1. 安琪酵母股份有限公司酿造与生物能源事业部，酿造与生物能源研究所， 宜昌，443003）

2.徐州恒顺万通食品酿造有限公司，徐州，221000；

　　摘要：应用顶空-固相微萃取（HS-SPME）结合气质色谱连用（GS-MS）的方法、高效液相色谱法(HPLC)以及滴定法等检测方法，研究通过外源性酵母添加在酱油浇淋工艺中产品的最终应用效果。检测结果显示在外源性添加了酱油酿造用酵母后，酱油主要香气挥发物、甘油以及总酯等都有了显著变化，酱油品质总体得到了明显提升。

　　关键词：酱油生产、酱油酵母、HS-SPME、GS-MS、高效液相色谱

　　酱油在中国具有非常悠久的历史，也是老百姓日常生活中非常重要调味品之一。酱油酿造归根结底是在特定条件下，多种微生物共同作用和繁多化学反应的综合作用结果。在整个酱油酿造过程中，相关微生物及其酶系作用对于酱油最终品质好坏具有决定性的作用[1-2]。

　　酱油浇淋发酵工艺从工艺过程上分类，是依照酱油高盐稀态发酵工艺特点融入低盐固态酱油发酵工艺的一种改进型工艺[3-4]。相比于高盐稀态工艺，酱油浇淋发酵工艺具有相对发酵时间较短，出油率较高的特点。相比于低盐固态工艺，浇淋工艺所产酱油在最终酱油品质上有了较大提升。然而，浇淋工艺相对较短的发酵时间，还是在一定程度上限制了酵母等酱油发酵有益微生物的生长和作用，因此，在酱油综合品质，尤其在香气方面，还与长时间传统高盐稀态发酵酱油有一定的差距。因此，采用外源性有益微生物添加，来弥补浇淋工艺由于发酵时间短导致的发酵微生物不足从而提高酱油品质成为行之有效的方法[5]。

　　本文重点在外源性添加酱油酿造用酵母后，对最终发酵产品的品质与传统工艺发酵产品进行了比较，在影响酱油品质关键物质上进行了检测和比较[6-7]。

　　1 材料与方法

　　1.1.1 原油样品

　　1#油样为公司传统浇淋工艺生产油；2#油样为采用外源性酵母添加后的生产油，其中生产添加酵母使用安琪酵母股份有限公司超活性酱油干酵母产品。

　　1.1.2 主要试剂

　　色谱级正己烷、3-甲基-2-庚酮，均购自美国 Sigma公司。

　　1.1.3 主要仪器

　　气相色谱质谱连用仪（GC6890-MS5975）美国 Agilent公司；色谱柱 DB-WAX 美国 Agilent公司；SPME固相萃取头（CAR/PDMS，75μm） 加拿大 Supelco公司；高效液相色谱仪（HPLC L-2000） 日本 HITACHI 公司。

　　1.2.1 挥发性成分检测

　　1.2.1.1 样品萃取

　　制样前将萃取头在GC进样口进行老化，老化温度250℃，时间30min。

　　取3g样品放入20ml SPME萃取小瓶，将小瓶放入50℃恒温水浴锅中平衡30min，之后将SPME萃取头插入萃取小瓶顶空吸附40min。

　　1.2.1.2 挥发性成分样品检测

　　平衡吸附完，通过GC-O-MS结合对其进行样品分析。将萃取头迅速插入GC进样口进样，萃取头进样后热解析5min。

　　气相色谱进行程序升温，升温条件及GC-O 的条件如下：

　　进样后，通过气相色谱毛细管柱进行分离，然后按照1：1：1的分流比例，分别将样品进入气相色谱FID检测器、质谱检测器（MSD）及嗅闻口（ODP），样品同时进入检测，减少检测误差。

　　气相色谱升温条件：起始40℃，维持3 min，以5℃/min升到200℃，维持0 min，再以10℃/min升到230℃，维持3 min。

　　质谱电子方式为EI，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃。溶剂延迟为3min。质谱扫描范围为35~650amu。化合物的质谱鉴定在谱库NIST 05a中进行。气相色谱和质谱接口处的温度为240℃和280℃。

　　本次检测，均以2-甲基-3-庚酮作为内标物进行半定量测定，测定结果虽无法完全显示成分精确含量，但完全可以显示在同等条件下，相关物质变化情况。

　　1.2.2 乙醇、甘油含量检测

　　高效液相色谱主要分析参数：主要分析参数：分析色谱柱：Aminex HPX-87 H, 300*7.8mm；保护柱：125-0129；流动相：0.005M H2SO4；温度：65℃；流速：0.6ml/min；进样量：15μL；分析时间：30min；检测器：Waters’ 410 视差折光检测器。

　　1.2.3 总酯总酸检测

　　准确吸取酱油试样25.00ml，用去离子水定容到250ml容量瓶中，混匀配成10%的稀释液，从中吸取10.00ml 于25ml 烧杯中，加去离子水60ml，放入搅拌子，用校准好的酸度计，以0.1mol/L NaOH 标准溶液滴定至pH至8.20，记录消耗的体积，由此计算酱油中总酸的含量。

　　将滴定后的酱油试样定量转移到350ml 圆底烧瓶中，准确加入25.00ml 0.1mol/L NaOH标准溶液，接上冷凝回流管，于沸水中回流皂化0.5h（从沸腾后第1滴液体下滴开始计时），取下并冷却至室温，定量移入250ml烧杯中，立即用0.1mol/L H2SO4标准溶液滴定至pH9.20，记录标准溶液用量，由此计算酱油中的总酯含量[8]。

　　2 结果与讨论

　　2.1 挥发性物质检测对比

　　图1 为本次检测的二个样品的谱图对比，1#为原工艺油样品，2#为添加酱油酵母油样品。

　　图1. 1#、2#的谱图检测结果比较

　　从样品检测图谱可以看出，在酱油的挥发性物质上，两个样品在一些成分物质上有非常明显的差别，说明在添加外源性酱油酿造类酵母后，酱油部分香气成分发生了明显的改变。根据谱图变化情况，我们简单将几个变化比较大的物质进行了谱图表明，如图2。

　　图2. 1#、2#的谱图变化情况分析

　　依据检测结果分析，2#油样在乙醇、苯乙醇、4-乙基愈创木酚等酱油关键物质上，都有了比较明显的提升，说明在外源添加酱油酿造类酵母后，强化了相关香味物质合成前体的生物代谢，并协同相关微生物发挥了邮箱的增香作用。例如苯甲酸乙酯等酯类物质的提高，可以归因为乙醇等前提物质的提高所致，而苯甲酸的相对降低也可以从侧面说明外源添加酵母对酱油中挥发成分的影响。

　　表1显示的本次检测中，部分挥发性物质的含量变化。

　　表1. 1#、2#样品中挥发物质检测比较

　　附：表中“*”表示检测微量物质，并不能代表其中没有该物质。

　　    2.2 乙醇甘油的精确定量分析

　　乙醇不但赋予酱油特有的醇香，而且是其他一些香型物质的合成前体。此外，一定量的乙醇还可以增加酱油的抗腐蚀性。甘油是酱油中主要的多元醇，可以增加酱油绵甜的口感，对酱油口感的提升有很重要的作用，这两种物质主要都是由酱油酿造过程中酵母作用生成，因此，这两种物质的含量也直接显示了酱油酵母在样品中所表现的生物活性的优劣。表2为本次检测结果。

　　表2. 高效液相色谱检测结果

　　表中“*”表示检测微量物质，并不能代表其中没有该物质。

　　从检测结果来看，添加了外源性酵母的原油样品在乙醇和甘油等成分上，均优于原有工艺油样。乙醇和甘油是酵母碳代谢的主要产物，酵母的添加和强化为样品中这两个组分的提高，提供了生物学保证。

　　2.3 总酸、总酯精确定量分析

　　表3为总酸、总酯检测结果

　　表3. 总酸、总酯检测结果

　　从检测结果上看，在添加了外源酵母后，总酸略有增加，但是在总酯上，有大幅度提升，这个也与前面乙醇等酯类前体物质有提升相吻合。

　　3. 结论

　　在现有工艺条件下，添加了酱油发酵用酵母后，在酱油香气微分上，有了明显变化，尤其是在以乙醇、苯乙醇、4-乙基愈创木酚等挥发性特征物质上，均有明显提高。而酱油中的甘油含量的较大提升，对酱油口感有一定的改善作用。在使用酱油酵母辅助发酵后，总酸变化不大，但是在总酯上，有明显提升，可以从整体上丰富酱油的香气感官。

　　本次检测结果充分说明，在现有浇淋发酵工艺基础上进行外源性的酱油酿造类微生物添加，可以有效的提升酱油品质，此外生产中干酵母直接活化添加方式对人员和设备要求不高，便于操作的规范化和产品的稳定化，该方法在酱油生产上具有一定的借鉴意义。

　　参考文献

1. 徐清萍. 酱油生产技术问答[M]. 北京：中国纺织出版社, 2011, 4-20.
2. 包启安. 酱油科学与酿造技术[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2011, 119-149.
3. 黄持都, 鲁绯. 低盐固态与原池浇淋工艺的比较[J]. 中国酿造, 2010(9): 5-7.
4. 张海珍, 蒋予箭, 陈敏. 淋浇工艺对低盐固态酿造酱油风味的影响[J]. 中国调味品, 2009, 34(8): 91-94.
5. Catrinus van der Sluis, Johannes Tramper, Rene H. Wijffels. Enhancing and accelerating flavour formation by salt-tolerant yeasts in Japanese soy-sauce processes[J]. Trends in Food Science & Technology, 2001, 12(9): 322-327.
6. 雷锦成, 常煦, 宋焕禄. 酱油活性干酵母在酱油中的应用效果研究[J]. 中国调味品, 2013, 38(2): 1-3.
7. Jianxin Zhao, Xiaojun Dai, Wei Chen. Comparaison fo aroma compounds in naturally fermented and inoculated Chinese soybean pastes by GC-MS and BC-Olfactometry analysis[J]. 2011, 22(6): 1008-1013.
8. 齐凤元. 关于酱油中总酸、总酯含量连续分析技术的研究[J]. 中国酿造, 2004(6): 34-35

The application effect of salt-tolerance yeast in spraying and extracting soy sauce production

　　Quan Wu, He Guang-hui, Chang Xu, Lei Jin-cheng

1. Xuzhou Hengshun Wantong Food Brewing Co., Ltd, Xuzhou, 221000, China；

　　2. Brewing & Bioenergy Research Institution, Brewing & Bioenergy Business Unit, Angel Yeast Co., Ltd, Yichang 443003, China）

　　Abstract: Head-Space Solid-phase micro-extraction (HS-SPME), capillary gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS),HPLC and titration method were used to determinate some important substances in soy sauce. The soy sauce produced within and without adding salt-tolerance yeast was compared. The result shows that adding salt-tolerance yeast in spraying and extracting soy sauce fermentation can improve the quality of products effectively.  

　　Keywords：soy sauce production, salt-tolerance yeast, HS-SPME, GS-MS, HPLC